常用缓冲液的配置方法 -- 基础知识 -- 阔思软件部返回

  • 缓冲液是一种能在加入少量酸或碱时抵抗pH改变的溶液。

    PH缓冲系统对维持生物的正常pH值,正常生理环境起重要作用。

    多数细胞仅能在很窄的pH范围内进行活动,而且需要有缓冲体系来抵抗在代谢过程中出现的pH变化。

    在生物体中有三种主要的pH缓冲体系,它们时蛋白质、重碳酸盐缓冲体系。每种缓冲体系所占的分量在各类细胞和器官中是不同的。
    在生化研究工作中,常常要用到缓冲溶液来维持实验体系的酸碱度。研究工作的溶液体系pH值的变化往往直接影响到我们工作的成效。

    如果提取酶实验体系的pH值变化或变化过大,会使酶活性下降甚至完全失活。所以我们要学会配制缓冲溶液。
    由弱酸及其盐组合一起使具有缓冲作用。

    生化实验室常常用的缓冲系主要有磷酸、柠檬酸、碳酸、醋酸、巴比妥酸、Tiris(三羟甲基氨基甲烷)等系统,在生化实验或研究工作中要慎重地选择缓冲体系,因为有时影响实验结果的因素并不是缓冲液的pH值,而是缓冲液中的某种离子。

    如硼酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐和三羟甲基甲烷等缓冲剂都可能产生不需要的反应。
    硼酸盐:硼酸盐与许多化合物形成复盐、如蔗糖。
    柠檬酸盐:柠檬酸盐离子容易与钙结合,所以存在有钙离子的情况下不能使用。
    磷酸盐:在有些实验,它是酶的抑止剂或甚至是一个代谢物,重金属易以磷酸盐的形式从溶液中沉淀出来。

    而且它在pH7.5以上时缓冲能力很小。
    三羟甲基氨基甲烷:它可以和重金属一起作用,但在有些系统中也起抑止的作用。

    其主要缺点时温度效应。

    这点往往被忽视,在室温pH是7.8的Tris一缓冲液,在4℃时是8.4,在37℃时是7.4,因此,4℃配制的缓冲液拿到37℃测量时,其氢离子浓度就增加了10倍。而且它在pH7.5以下,缓冲能力很差。
    缓冲液的pH值由哪些因素决定?
    设缓冲系统的弱酸的电离常数为K(平衡常数),平衡时弱酸的浓度为[酸],弱酸盐的浓度为[盐],则由弱酸的电离平衡式可得下式:
    根据此式可得出下列几点结论:
    (1)缓冲液的pH值与该酸的电离平衡常数K及盐和酸的浓度有关。弱酸一定,但酸和盐的比例不同时,可以得到不同的pH值。当酸和盐浓度相等时,溶液的pH值与PK值相同。
    (2)酸和盐浓度等比例也增减时,溶液的pH值不便。
    (3)酸和盐浓度相等时,缓冲液的缓冲效率为最高,比例相差越大,缓冲效率越低,一般地说缓冲液有效缓冲范围为PK±1pH。
    从上述可知,只要知道缓冲对的PK值,和要配制的缓冲液的pH值(及要求的缓冲液总浓度)时,可按公式计算出[盐]和[酸]的量。

    这样算涉及到对数的换算,较麻烦,前人为减少后人的计算麻烦,经计算已为我们总结出pH值与缓冲液对离子用量的关系列出了表格。

    讲义附录部分节录有磷酸缓冲液的配制表。只要我们知道要配制的缓冲液的pH,经查表便可计算处所用缓冲剂的比例和用量。

    例如配制500nmpH5.8浓度为0.1M磷酸缓冲液。
    经查表知pH5.8浓度为0.2M Na2HPO48.0毫升,而0.2M Na2HPO492.0毫升。

    依此可推论出配制100ml0.1M的磷酸缓冲液需要0.1M Na2HPO48.0毫升,而0.1M Na2HPO4需要92.0毫升。
    所以500ml 0.1M磷酸缓冲液需要Na2HPO4量为:
    需Na2HPO4量为 :
    计算好后,按计算结果称好药品,放于烧杯中,加少量蒸馏水溶解,转移入50ml容量瓶,加蒸馏水至刻度,摇匀,便得所需的缓冲液。
    各种缓冲溶液的配制,均按下表按比例混合,某些试剂,必须标定配成准确的浓度才能进行,如醋酸、NaOH等

    1.甘氨酸-盐酸缓冲液(0.05M)
    X ml 0.2M甘氨酸 +Y ml 0.2M盐酸 再加水稀释至200ml
    pH X/ml Y/ml pH X/ml Y/ml
    2.2 50 44.0 3.0 50 11.4
    2.4 50 32.4 3.2 50 8.2
    2.6 50 24.2 3.4 50 6.4
    2.8 50 16.8 3.6 50 5.0
    甘氨酸分子量=75.07 0.2M甘氨酸溶液含15.01g/L

    2.邻苯二甲酸-盐酸缓冲液(0.05M)
    X ml 0.2M邻苯二甲酸氢钾 +Y ml 0.2M盐酸 再加水稀释至200ml
    pH X Y pH X Y
    2.2 5 4.670 3.2 5 1.470
    2.4 5 3.960 3.4 5 0.990
    2.6 5 3.295 3.6 5 0.597
    2.8 5 2.642 3.8 5 0.263
    3.0 5 2.032
    邻苯二甲酸氢钾分子量=2.4.23 0.2M邻苯二甲酸氢钾溶液含40.85g/L

    3.磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液

    pH 0.2M Na2HPO4/ml 0.1M柠檬酸/ml pH 0.2M Na2HPO4/ml 0.1M柠檬酸/ml
    2.2 0.40 19.6 5.2 10.72 9.28
    2.4 1.24 18.76 5.4 11.15 8.85
    2.6 2.18 17.82 5.6 11.60 8.40
    2.8 3.17 16.83 5.8 12.09 7.91
    3.0 4.11 15.89 6.0 12.63 7.37
    3.2 4.94 15.06 6.2 13.22 6.78
    3.4 5.70 14.30 6.4 13.85 6.15
    3.6 6.44 13.56 6.6 14.55 5.45
    3.8 7.10 12.90 6.8 15.45 4.55
    4.0 7.71 12.29 7.0 16.47 3.53
    4.2 8.28 11.72 7.2 17.39 2.61
    4.4 8.82 11.18 7.4 18.17 1.83
    4.6 9.35 10.65 7.6 18.73 1.27
    4.8 9.86 10.14 7.8 19.15 0.85
    5.0 10.30 9.70 8.0 19.45 0.55
    Na2HPO4分子量=141.98 0.2M溶液含28.40g/L
    Na2HPO4·2H2O分子量=178.05 0.2M溶液含35.61g/L
    C6H8O7·H2O分子量=210.14 0.1M溶液含21.01g/L

    4.柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液

    pH 钠离子浓度/M 柠檬酸C6H8O7·H2O/g 氢氧化钠NaOH/g 浓盐酸HCl/ml 终体积/L
    2.2 0.20 210 84 160 10
    3.1 0.20 210 83 116 10
    3.3 0.20 210 83 106 10
    4.3 0.20 210 83 45 10
    5.3 0.35 245 144 68 10
    5.8 0.45 285 186 105 10
    6.5 0.38 266 156 126 10
    使用时可以每升中加入1g酚,若最后pH有变化,再用少量50%氢氧化钠溶液或浓盐酸调节,冰箱保存。

    柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(0.1M)

    pH 0.1M柠檬酸/ml 0.1M柠檬酸钠/ml pH 0.1M柠檬酸/ml 0.1M柠檬酸钠/ml
    3.0 18.6 1.4 5.0 8.2 11.8
    3.2 17.2 2.8 5.2 7.3 12.7
    3.4 16.0 4.0 5.4 6.4 13.6
    3.6 14.9 5.1 5.6 5.5 14.5
    3.8 14.0 6.0 5.8 4.7 15.3
    4.0 13.1 6.9 6.0 3.8 16.2
    4.2 12.3 7.7 6.2 2.8 17.2
    4.4 11.4 8.6 6.4 2.0 18.0
    4.6 10.3 9.7 6.6 104 18.6
    4.8 9.2 10.8
    C6H8O7·H2O分子量=210.14 0.1M溶液含21.01g/L
    Na3C6H5O7·2H2O分子量=294.12 0.1M溶液含29.41g/L

    6.乙酸-乙酸钠缓冲液(0.2M)

    pH 0.2M NaAc/ml 0.2M HAC/ml pH 0.2M NaAc/ml 0.2M HAC/ml
    3.6 0.75 9.25 4.8 5.90 4.10
    3.8 1.20 8.80 5.0 7.00 3.00
    4.0 1.80 8.20 5.2 7.90 2.10
    4.2 2.65 7.35 5.4 8.60 1.40
    4.4 3.70 6.30 5.6 9.10 0.90
    4.6 4.90 5.10 5.8 9.40 0.60
    NaAc分子量=136.09 0.2M溶液为27.22g/L

    7.磷酸盐缓冲液
    (1)磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(0.2M)

    pH 0.2M Na2HPO4/ml 0.2M NaH2PO4/ml pH 0.2M Na2HPO4/ml 0.2M NaH2PO4/ml
    5.8 8.0 92.0 7.0 61.0 39.0
    5.9 10.0 90.0 7.1 67.0 33.0
    6.0 12.3 87.7 7.2 72.0 28.0
    6.1 15.0 85.0 7.3 77.0 23.0
    6.2 18.5 81.5 7.4 81.0 19.0
    6.3 22.5 77.5 7.5 84.0 16.0
    6.4 26.5 73.5 7.6 87.0 13.0
    6.5 31.5 68.5 7.7 89.5 10.5
    6.6 37.5 62.5 7.8 91.5 8.5
    6.7 43.5 56.5 7.9 93.0 7.0
    6.8 49.5 51.0 8.0 94.7 5.3
    6.9 55.0 45.0
    Na2HPO4·2H2O分子量=178.05 0.2M溶液含35.61g/L
    Na2HPO4·12H2O分子量=358.22 0.2M溶液含71.64g/L
    NaH2PO4·H2O分子量=138.01 0.2M溶液含27.6g/L
    NaH2PO4·2H2O分子量=156.03 0.2M溶液含31.21g/L

    (2) 磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液(1/15M)

    pH 1/15M Na2HPO4/ml 1/15M KH2PO4/ml pH 1/15M Na2HPO4/ml 1/15M KH2PO4/ml
    4.92 0.10 9.90 7.17 7.00 3.00
    5.29 0.50 9.50 7.38 8.00 2.00
    5.91 1.00 9.00 7.73 9.00 1.00
    6.24 2.00 8.00 8.04 9.50 0.50
    6.47 3.00 7.00 8.34 9.75 0.25
    6.64 4.00 6.00 8.67 9.90 0.10
    6.81 5.00 5.00 9.18 10.00 0
    6.98 6.00 4.00
    Na2HPO4·2H2O分子量=178.05 1/15M溶液含35.61g/L
    KH2PO4分子量=136.09 1/15M溶液含9.078g/L

    8.磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液(0.05M)
    X ml 0.2M KH2PO4 +Y ml 0.2M NaOH 再加水稀释至20ml
    pH(20℃) X/ml Y/ml pH(20℃) X/ml Y/ml
    5.8 5 0.372 7.0 5 2.963
    6.0 5 0.570 7.2 5 3.500
    6.2 5 0.860 7.4 5 3.950
    6.4 5 1.260 7.6 5 4.280
    6.6 5 1.780 7.8 5 4.520
    6.8 5 2.365 8.0 5 4.680

    9.巴比妥钠-盐酸缓冲液(18℃)

    pH 0.04M巴比妥钠/ml 0.2M盐酸/ml pH 0.04M巴比妥钠/ml 0.2M盐酸/ml
    6.8 100 18.4 8.4 100 5.21
    7.0 100 17.8 8.6 100 3.82
    7.2 100 16.7 8.8 100 2.52
    7.4 100 15.3 9.0 100 1.65
    7.6 100 13.4 9.2 100 1.13
    7.8 100 11.47 9.4 100 0.70
    8.0 100 9.39 9.6 100 0.35
    8.2 100 7.21 100
    巴比妥钠分子量=206.18 0.04M溶液为8.25g/L

    10.Tris-盐酸缓冲液
    50ml 0.1M三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶液于X ml 0.1M盐酸混匀后,加水稀释至100ml
    pH X/ml pH X/ml
    7.1 45.7 8.1 26.2
    7.2 44.7 8.2 22.9
    7.3 43.4 8.3 19.9
    7.4 42.0 8.4 17.2
    7.5 40.3 8.5 14.7
    7.6 38.5 8.6 12.4
    7.7 36.6 8.7 10.3
    7.8 34.5 8.8 8.5
    7.9 32.0 8.9 7.0
    8.0 29.2
    三羟甲基氨基甲烷(Tris)分子量=121.14 0.1M溶液为12.114g/L
    Tris溶液可以从空气中吸收二氧化碳,使用时注意将瓶盖严

    11.硼酸-硼砂缓冲液(0.2M硼酸根)

    pH 0.05M硼砂/ml 0.2M硼酸/ml pH 0.05M硼砂/ml 0.2M硼酸/ml
    7.4 1.0 9.0 8.2 3.5 6.5
    7.6 1.5 8.5 8.4 4.5 5.5
    7.8 2.0 8.0 8.7 6.0 4.0
    8.0 3.0 7.0 9.0 8.0 2.0
    硼砂Na2B4O7·10H2O分子量=381.43 0.05M(=0.2M硼酸根)溶液为19.07g/L
    硼酸H3BO3分子量=61.84 0.2M溶液为12.37g/L
    硼砂易失去结晶水,必须在带塞的瓶中保存

    12.甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(0.05M)
    X ml 0.2M甘氨酸 +Y ml 0.2M氢氧化钠 再加水稀释至200ml
    pH X/ml Y/ml pH X/ml Y/ml
    8.6 50 4.0 9.6 50 22.4
    8.8 50 6.0 9.8 50 27.2
    9.0 50 8.8 10.0 50 32.0
    9.2 50 12.0 10.4 50 38.6
    9.4 50 16.8 10.6 50 45.5
    甘氨酸分子量=75.07 0.2M甘氨酸溶液含15.01g/L

    13.硼砂-氢氧化钠缓冲液(0.05M硼酸根)
    X ml 0.05M硼砂 +Y ml 0.2M氢氧化钠 再加水稀释至200ml
    pH X/ml Y/ml pH X/ml Y/ml
    9.3 50 6.0 9.8 50 34.0
    9.4 50 11.0 10.0 50 43.0
    9.6 50 23.0 10.1 50 46.0
    硼砂Na2B4O7·10H2O分子量=381.43 0.05M(=0.2M硼酸根)溶液为19.07g/L

    14.碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液(0.1M)
    Ca2+,Mg2+存在时不得使用
    pH 0.1M碳酸钠/ml 0.1M碳酸氢钠/ml
    20℃ 37℃
    9.16 8.77 1 9
    9.40 9.12 2 8
    9.51 9.40 3 7
    9.78 9.50 4 6
    9.90 9.72 5 5
    10.14 9.90 6 4
    10.28 10.08 7 3
    10.53 1028 8 2
    10.83 1057 9 1
    Na2CO3·10H2O分子量=286.2 0.1M溶液为28.62g/L
    NaHCO3分子量=84.0 0.1M溶液为8.40g/L